实验概要：本实验旨在利用LOWRY法对蛋白质含量进行测定，为生物医药领域的研究提供有效的数据支持。

实验原理：LOWRY法是双缩脲法与福林酚法的结合和发展。其基本原理为：在碱性条件下，对蛋白质溶液加入铜离子溶液，形成铜-蛋白质的络合物。在随后加入酚试剂后，能够使得肽链中的酪氨酸、色氨酸及半胱氨酸等显色，同时增强双缩脲法中肽键与铜离子的显色效果。因此，LOWRY法的显色强度比单独使用酚试剂的效果强3至15倍，并且是双缩脲法的100倍。此种显色增强效果可有效减少因蛋白质种类差异导致的测量偏差。

LOWRY法所用试剂由两部分组成：第一部分是双缩脲试剂（即碱性铜溶液），能够与蛋白质中的肽键反应并产生显色；第二部分是混合液，包括磷钨酸和磷钼酸，在碱性条件下容易还原成蓝色反应。因此，蛋白质中的酪氨酸和胱氨酸等氨基酸的浓度与显色强度呈正比关系。

主要试剂：Na2WO4•2H2O、Na2MoO4•2H2O、85% H3PO4、浓 HCl、Li2SO4•H2O、溴水、酚酞指示剂、Na2CO3、NaOH、CuSO4•5H2O、酒石酸钾钠、牛血清白蛋白（用水配制成250mg/ml）。

主要设备：若干试管、刻度吸管（0.5ml、1ml、10ml）、定量加样器、圆底烧瓶、一套冷凝管（带橡胶管）、微量滴定管、小烧杯、微量进样器（50μl）、分光光度计。

实验步骤：

1. 酚试剂的制备：

（1）在1500ml的圆底烧瓶中混合100g Na2WO4•2H2O、25g Na2MoO4•2H2O与700ml蒸馏水，随后加入85% H3PO4 50ml及浓 HCl 100ml。安装回流冷却装置，缓慢加热至沸腾，持续10小时。冷却后加入150g Li2SO4•H2O、50ml水与浓 HCl 100ml，再加热煮沸15分钟以去除过量的溴。最后，冷却后稀释至100ml并过滤保存于棕色瓶中，置于冰箱保存。

（2）配制4% Na2CO3溶液、0.2mol/L NaOH溶液、1% CuSO4溶液及2%酒石酸钾钠溶液。使用前，将前两者等体积混合为Na2CO3-NaOH溶液，后两者等体积混合以形成硫酸铜-酒石酸钾钠溶液。按50:1的比例混合这两个溶液，得到Folin-酚试剂甲液，该试剂只能使用一天。

2. 标准曲线的绘制：

（1）准备7只试管，分别加入0ml、0.1ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml及1.0ml标准蛋白质溶液，用水补至1ml，形成标准系列（蛋白质含量分别为0mg、25mg、50mg、100mg、150mg、200mg、250mg）。必要时可重复实验。

（2）加入5ml试剂甲，混合后在30℃下静置10分钟。

（3）迅速加入0.5ml试剂乙，立即振荡混匀，并在30℃下保持30分钟。

（4）在30分钟后，以未加标准蛋白的试管作为空白，利用分光光度计在500nm波长下测定吸光度值。

（5）将蛋白浓度绘制为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

3. 样品测定：

（1）取50μl样液置于试管中（样液提取方法按0.1g鲜样/ml比例），用蒸馏水补至1ml，随后重复标准曲线步骤2的（2）、（3）、（4），并以空白为对照，测量吸光度值。

（2）根据吸光度值查找标准曲线，计算样品中的蛋白质含量。

4. 结果计算：蛋白质含量（mg/g鲜重）可通过以下公式计算：

蛋白质含量 (mg/g鲜重) = (C * V / a) / W

其中，C为从标准曲线得到的样品蛋白质含量（mg），V为提取液总量（ml），a为测定时的样液量（ml），W为取样量（g）。

注意事项：

1. Folin试剂乙在酸性条件下稳定，加入碱性铜-蛋白质溶液后需立即混匀，以确保还原反应顺利发生。

2. 为确保反应完全，需在25至30℃的水浴中反应30分钟后再进行比色。

3. 还原物质可能干扰实验结果。考马斯亮蓝法与LOWRY法均为高灵敏度的定量测定蛋白质方法，分别适用于不同实验需求。需注意LOWRY法可能受到植物体内酚类物质的干扰。

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