校正染料(ROX)不仅能够校正加样误差或孔间误差,还提供了一个稳定的基线,从而显著提高定量分析的精确性,并增强了重复管之间数据的重现性。在使用过程中,请注意,不同仪器对ROX的需求是有所不同的。基线PCR的初期几个循环中,荧光信号几乎不发生变化,设定的阈值应为信号的最小可置信荧光值,而CT值则代表扩增曲线与阈值相交的横坐标。
**结果有效性判断** 评估结果的有效性时,我们关注融解曲线是否单峰(染料法)、扩增曲线是否处于指数扩增区域。复孔之间的CT值标准差应小于0.2,阈值应合理设定在指数增长期。虽然仪器会自动计算阈值,但并非在所有情况下都可靠,必要时必须手动调整。 NTC(无模板对照)可用于确认无气溶胶污染,若ΔCT=NTC(CT值)-目的基因(CT值)≥3或≥5,通常表明气溶胶污染不会影响实验结果的准确性。 NRT(无逆转录对照)用于确认无基因组残留,若ΔCT=NRT(CT值)-目的基因(CT值)≥3或≥5,通常意味着基因组残留对实验结果的准确性无显著影响。待测CT值应位于线性范围内,且扩增效率需符合标准,PCR扩增效率(e)应在90%-120%之间。
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